一、目的要求
瞭解過氧化物酶的作用，掌握愈創木酚法測定果蔬組織中過氧化物酶活性的方法。
二、基本原理
過氧化物酶（Peroxidase，POD）是果蔬體內普遍存在的一種重要的氧化還原酶，它與果蔬的許多生理過程和生化代謝過程都有密切關系。在果蔬的生長發育、成熟衰老過程、抗病、抗氧化、抗逆境脅迫中，POD活性不斷發生變化。在受到外界刺激、病原菌侵染、貯藏環境變化、加工條件改變等作用時，果蔬組織中POD酶活性都會做出相應得應答反應。
過氧化物酶催化過氧化氫（H2O2）氧化酚類物質產生醌類化合物。這些化合物進一步縮合或與其它分子縮合形成顏色較深的化合物。在過氧化物酶催化作用下，過氧化氫能將愈創木酚（鄰甲氧基苯酚）氧化形成4-鄰甲氧基苯酚。該產物呈紅棕色，在470 nm處有最大光吸收，故可通比色法測定過氧化物酶的活性。
三、材料、儀器及試劑
（一）材料
各種水果和蔬菜。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、分光光度計、秒表、移液器、離心管、試管、容量瓶（100 mL，1 000 mL）。
（三）試劑
1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液
母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸餾水稀釋至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L醋酸鈉溶液）：稱取16.4 g無水醋酸鈉（或稱取27.2 g三水合乙酸鈉），用蒸餾水溶解、定容至1 000 mL。
取68 mL母液A和432 mL母液B混合後，調節pH至5.5，加蒸餾水稀釋至1 000 mL。
2．50 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液
3．提取緩沖液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）
稱取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液溶解、稀釋至100 mL。
4．25 mmol/L愈創木酚溶液
取320 μL愈創木酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液稀釋至100 mL。
5．0.5 mol/L H2O2
取1.42 mL 30% H2O2溶液（30% H2O2的摩爾濃度約為17.6 mol/L），用50 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液稀釋至50 mL，現用現配，避光保存。
四、實驗步驟
（一）酶液制備
稱取5.0 g果蔬組織樣品，置於研缽中，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿，於4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，低溫保存備用。
（二）活性測定
取一支試管，加入3.0 mL 25 mmol/L愈創木酚溶液和0.5 mL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應，同時立即開始計時。將反應混合液倒入比色杯中，置於分光光度計樣品室中。以蒸餾水為參比，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長470 nm處吸光度值作為初始值，然後每隔1 min 記錄一次，連續測定，至少獲取6個點的數據。重復三次。
五、實驗結果與計算
1．將測定的數據填入下表
2．計算結果
記錄反應體系在470 nm處的吸光度值，制作OD470值隨時間變化曲線，根據曲線的初始線性部分計算每分鐘吸光度變化值△OD470。然後，以每克鮮重（FW）果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個過氧化物酶活性單位（U），則U =△OD470·min-1·g-1 FW。計算公式：
式中：
△OD470——反應混合液的吸光度變化值；
△t ——酶促反應時間，min；
V ——樣品提取液總體積，mL；
Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；
W ——樣品重量，g。
過氧化物酶活性還可以每分鐘反應體系在波長470 nm處吸光度值讀數變化增加1時所需的酶量為1個活性單位（U），表示為U = △OD470·min-1·mg-1蛋白質。酶提取液中蛋白質含量可利用考馬斯亮藍染色法進行測定。即：
其中，C表示酶提取液中蛋白質含量（mg/mL）。這裡所計算的實際上是酶的比活力，有利於減少操作過程帶來的誤差。
六、註意事項
1．應進行預實驗。測定每一分鐘反應體系的吸光度值的變化，確定該酶促反應速度呈線性變化（初級反應）的時間段。這樣，隻測定某一段時間內反應液的初始吸光度值（OD0）和最終值（ODt）這兩個數據，就可以計算每分鐘吸光度值的變化量。
2．利用100 mmol/L、pH 6.0磷酸緩沖液作為提取液，可以提取多數果蔬組織中過氧化物酶。配制方法：
母液A：0.2 mol/L Na2HPO4 溶液（53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.64 g Na2HPO4·12H2O配成1000 mL）。
母液B：0.2 mol/L NaH2PO4 溶液（27.6 g NaH2PO4·H2O或31.2 g NaH2PO4·2H2O配成1000 mL）。
分別取12.3 mL母液A與87.7 mL母液B充分混勻，調節pH值，稀釋至200 mL。樣品提取液中的其它成分根據需要加入。
3．在提取緩沖液中加入PEG，PVPP和Triton X-100等是為瞭提高酶蛋白的溶解性，減少提取過程中酶活性的損失。這些物質的具體作用可以參閱本書第一篇相關內容。