撰文 | 武林 （紐約大學醫學院）
細胞代謝是一切生命體得以存在的基礎。細胞從環境中獲取營養物質，通過一系列的酶活反應，將營養物質轉化為支持細胞各種功能的代謝產物。這其中包括生命科學裡耳熟能詳的代謝產物，譬如氨基酸、核苷酸、脂肪酸、能量分子ATP，也有一些教科書上經常看到的，最近研究的也比較多的分子，例如乙酰輔酶A等，更多的則是平時鮮有機會見到的分子。我們所知道的所有細胞活動，譬如DNA合成、蛋白質合成、表觀調控、各種信號通路的激活傳遞、細胞之間的通信等全部依托於細胞代謝所產生的代謝產物，所以很長一段時間以來，細胞代謝被看作是細胞的後勤部門——細胞需要什麼，後勤部門就提供什麼來滿足細胞的要求。
最近許多觀點更是認為細胞代謝不僅僅是作為各個細胞功能的後勤部門，它其實可以在某種程度上決定瞭細胞的功能，譬如表觀遺傳可以直接被細胞內各種相關代謝物的濃度所影響，從而進一步影響細胞功能【1】。
正是因為代謝在調控細胞功能中的重要作用，通過藥物手段調節細胞代謝活性是一種有效的抑制致病細胞的手段。畢竟，不管失活的是後勤部門還是主管部門，細胞都不可能再進行正常的細胞活動。這就是為什麼大傢能看到越來越多的關於代謝的研究出現在生命科學和醫學的各個領域的原因之一。然而，也正是因為細胞代謝對每個細胞的重要性，抑制細胞代謝會造成無差別殺傷——不僅是致病細胞被抑制，那些維持人體正常功能的健康細胞也可能會被抑制。這其實是目前關於代謝研究的一個大問題。
從制藥的角度去看，除非藥物可以給到體內的特定細胞，否則這些方法必然會大大受制於毒副作用。一個比較著名的例子是Gapdh抑制劑3-bromopyruvate【2】。Gapdh是糖酵解通路中的一個酶。糖酵解幾乎在每個細胞中都存在。它以葡萄糖為底物，為細胞提供生存的各種基本物質 （氨基酸、脂肪酸、核苷酸、ATP等等）。
正是因為糖酵解的重要功能，在許多快速分裂的細胞中，它的活性都大大加強瞭，譬如腫瘤細胞和T淋巴細胞【3】。也正是因為這個原因，抑制糖酵解被認為是一種可以抑制腫瘤生長的手段。Gapdh抑制劑3-bromopyruvate也是由於這個原因在德國被應用在腫瘤病人身上，但是不幸的是，這種藥物導致瞭3個病人的死亡。
考慮到糖酵解通路的重要性，這種結果其實並不意外。用這個例子其實想說明一點，通過藥物抑制代謝通路來抑制致病細胞並不難——可能抑制任何一條重要的代謝通路都可以達到這種目的。但是這個問題的難點在於如何控制這種方法使得人體大部分正常細胞不會被影響。
2020年7月1日，美國紐約大學醫學院Dan R. Littman博士和武林博士在Cell上發表文章Niche-Selective Inhibition of Pathogenic Th17 Cells by Targeting Metabolic Redundancy，為解決這個問題提供瞭一個全新的思路。
細胞代謝通路在大部分人的印象中就像是一條條單獨的地鐵線，每一條線是一種獨特的代謝通路，每一站代表一種代謝產物，兩站之間的列車代表瞭催化該反應的酶，在某一地鐵線的任何一處設置瞭路障都會把這條路給封死，就像把Gapdh抑制住就可以把整條糖酵解通路關閉一樣。但是實際上，我們應該用網絡的概念去看待代謝通路 （圖1），就像現實生活中地鐵線是交錯在一起的。
很多時候在某一條地鐵線由於各種原因不通的情況下，我們還是可以乘坐其他地鐵線到達目的地，雖然這可能會延長乘坐地鐵的時間，增加換站的次數。和地鐵網絡一樣，在代謝網絡裡，有一些代謝產物是可以被多條通路合成和利用的，當某一條合成這種代謝物的通路被阻斷時，細胞還是可以利用其它的通路去合成這種物質。
這種多條通路產生相同產物的現象在生命科學裡稱之為冗餘（redundancy）。我們的研究發現，由於冗餘通路的補償作用，對抑制功能冗餘的酶所產生的毒副作用要遠遠小於對相同通路內非冗餘酶的抑制。
另外一個重要的發現是，特定的生存環境會改變冗餘通路的活性，導致在正常情況下冗餘的通路變得不再冗餘。相應的，在這種特定環境下將這種不再冗餘的位點阻斷的話會對細胞產生致命性的影響。將這兩個發現放到一起，就是我們的研究提出的一個重要概念 – 通過抑制基於環境因素選擇性冗餘的酶達到（1）抑制處於病灶環境中的致病細胞，和同時（2）降低對於健康組織細胞的毒副作用（圖2）。
圖1. 細胞中的“地鐵線”。圖片所展現的隻是部分代謝通路。圖片來源於Biochemistry 8th Edition
圖2. 本研究的三個結論。（1）由於補償元素的存在，對冗餘代謝通路的抑制可以被許多細胞耐受。如山下兩條冗餘的通路，封住其中一條並不會影響上山的途徑；（2）通路活性可以被環境因素影響，使得本來冗餘的通路變得不再冗餘。如山上的兩條通路其中一條被大雪覆蓋住，另外一條就是唯一的一條上山的路徑；（3）利用這種選擇性冗餘的特點，阻斷相同的通路可以選擇性抑制特定環境下的致病細胞。如圖中紅色路障牌放在山上和山下是兩種不同的結果 – 在山上可以徹底阻斷通路，在山下不會影響通路的運行。
研究手段和具體發現
我們研究的是一種叫做Th17的CD4+ T細胞亞型，這種亞型是從靜息CD4+ T細胞分化而來。Th17細胞平時在我們體內維持組織的動態平衡以及保護我們不被真菌以及其它一些細菌感染【4-6】。但是也是這種細胞，被一些特定的原因激活後會導致許多自身免疫疾病的發生，譬如慢性腸炎，銀屑病，強制性脊柱炎等。我們稱呼前者為非致病性Th17，後者為致病性Th17。
由於兩者都是Th17，他們有著相似的核心分化程序和細胞因子網絡。目前為止，特異性的針對致病性Th17的治療方式是抑制其核心程序分子，譬如利用anti-IL23和anti-IL17抗體去阻斷Th17的分化和功能【7-10】。這些方法會不可避免的抑制非致病性Th17的功能。目前還沒有已知的方法去特異性的抑制致病性Th17，而不影響非致病性Th17。為瞭研究如何特異性的抑制致病性Th17，我們首先比較瞭小鼠內兩種細胞轉錄組的區別（致病性Th17是從EAE小鼠（研究多發性硬直的模型）的脊柱中分離獲得，非致病性Th17是從SFB（segmented filamentous bacteria，一種存在在小腸中的共生細菌，會誘導非致病性Th17在small intestine lamina propria （SILP）的生成）感染的健康小鼠的SILP中分離獲得）。同時，我們建立瞭一套基於CRISPR技術的在體內敲除靜息CD4+ T細胞基因的方法。
這種方法需要將抗原特異性並且表達Cas9的靜息T細胞從供體小鼠中分離出來，使用電轉技術將guide RNA序列導入細胞中，然後立即將細胞回輸到實驗小鼠中。這些回輸的靜息T細胞會和正常的抗原特異性細胞一樣在體內進行分化，遷移和工作，唯一的不同是他們會在三天內變為基因敲除細胞。
通過與同時回輸的野生型對照細胞進行比較，我們可以知道被敲除基因是如何在小鼠體內純生理環境下調控T細胞的分化和功能。相比最近開始流行的利用病毒載體敲除基因的方法，我們的方法避免瞭體外培養、激活、標記篩選等一系列需要人工且繁瑣的操作，因此其更加準確、可靠、和快速。利用這種技術，我們敲除瞭一系列在致病性Th17中高表達的基因，最終發現敲除糖酵解通路中的Gpi1可以完全抑制致病性Th17細胞在EAE病灶位點的增殖，以及EAE的發生。在慢性腸炎中我們也觀測到瞭相同的結果。更為重要的是，Gpi1的缺失並沒有對存在於SILP的非致病性Th17有明顯的影響。
這個結果非常出乎意料，因為糖酵解通路一直被視為維持細胞生存的必須通路。之前關於T細胞的研究也報道瞭糖酵解通路對於T細胞增殖的重要作用【11,12】。與這些報道的結果一致，當我們敲除該通路中的其他基因，譬如Gapdh、Tpi1、Ldha1的時候，這兩種Th17細胞都無法在體內存活。
有意思的是，從以往文獻和數據庫中我們也發現瞭一些證據說明瞭Gpi1的特殊性。有許多病人天生就存在糖酵解酶的缺陷（大部分酶活喪失）。如果存在缺陷的基因沒有同功酶，利如Tpi1和Pgk1，病人的神經發育，肌肉發育和血紅細胞會有嚴重缺陷 (Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] entry 190450, 311800)【13】。
雖然Gpi1並沒有同功酶，它的缺陷在絕大多數患者中並沒有造成患者神經和肌肉的異常，隻是造成瞭不同程度的貧血癥狀【14-18】。很早以前有小鼠研究也報道過Gpi1缺陷雖然會導致貧血的癥狀，但是70%的缺陷小鼠都可以正常存活【19】。所有的這些證據都表明雖然Gpi1是糖酵解通路中的一環， 但是相比於其他的糖酵解酶，它是一種被選擇性需要的糖酵解酶（譬如血紅細胞和致病性Th17細胞）。這其實正是理想藥靶的特點——有效的抑制靶細胞，以及不會對健康細胞產生毒性。
我們隨後通過體內體外基因敲除/雙敲除，配合metabolic tracing，flux analysis等一系列研究方法，闡明瞭Gpi1被選擇性需要的分子機制。還是用地鐵線作比喻，相比於其他的酶，Gpi1在糖酵解通路中的位置非常特殊。它的底物Glucose-6-phosphate可以進入另一條地鐵線pentose phosphate pathway （PPP），作為該通路的底物去合成其他物質（譬如NADPH，DNA，RNA）。有意思的是，PPP這條線隨後還可以合成Fructose-6-phosphate，或者glyceraldehyde-3-phosphate，從而再回歸到糖酵解這條線上，位置正好是Gpi1的下遊。我們的實驗發現，Gpi1的缺失並沒有阻斷糖酵解，細胞在這種情況下讓葡萄糖分子在PPP這條地鐵線上繞瞭一大圈後繼續回到糖酵解通路上來，依然能夠為細胞提供生存所需的各種物質（大分子合成前體以及ATP等等）。但是這樣繞一圈是有代價的，那就是效率的降低 – Gpi1缺陷Th17細胞從環境中獲取葡萄糖的速度降低瞭一倍左右。理論上講，在這種情況下，糖酵解涉及到的任何步驟，譬如生物大分子前體的合成速度以及ATP的生成速度，都會相應的降低，從而對細胞活性產生重大的影響。但是，我們觀測到的實際上的變化是細胞將有限的葡萄糖原料主要用於各種生物大分子前體的合成（例如serine，lysine，alanine等等），保證這些分子的合成不受影響。在這種情況下，能用於丙酮酸合成的葡萄糖就大大減少，因為丙酮酸合成的步驟就是糖酵解產生ATP的步驟（一個丙酮酸的產生伴隨著一個ATP的生成），因此細胞會大大減少糖酵解過程中ATP的合成量。為瞭保證細胞不會出現能源危機，細胞又利用瞭另外一個冗餘的通路來補償ATP的合成，那就是線粒體的有氧呼吸。值得註意的是，線粒體的有氧呼吸也需要利用糖酵解產生的丙酮酸作為底物。如果最終進入瞭有氧呼吸鏈，一個丙酮酸分子可以產生12.5個ATP。如果隻是進行糖酵解，丙酮酸會變為乳酸而不再生成ATP。Gpi1缺陷的細胞選擇將數量很少的原本應該轉化為乳酸的丙酮酸轉移到線粒體中進行有氧呼吸，從而完全彌補瞭在這種情況下糖酵解無法合成ATP的問題。所以，通過重新編排PPP和有氧呼吸這兩條代謝通路的活性，Gpi1缺陷的細胞可以保證充足的大分子前體和能量分子ATP的合成，從而保證非致病性Th17細胞的正常功能。為什麼在致病性Th17中Gpi1又是不可或缺的呢？這其實涉及到一個可以大書特書的領域，那就是環境因素對細胞代謝和細胞功能的影響。炎癥反應經常伴隨著組織低氧【20,21】，而線粒體的有氧呼吸是依賴於氧氣的。這就相當於有氧呼吸這條地鐵線在致病性Th17細胞中被天然阻斷瞭。在這種情況下，處於炎癥位點的致病性Th17細胞不再能夠靈活地編排代謝網絡來補償Gpi1缺陷導致的ATP損失，從而產生瞭能源危機，導致細胞無法繼續介導炎癥反應。至於其他的糖酵解酶，例如Gapdh，由於不存在冗餘的通路，對它的抑制會徹底阻斷糖酵解，從而導致致病性和非致病性細胞的死亡 （圖3簡要的概括瞭本文關於Gpi1的發現）。
圖3. Gpi1在不同環境中的選擇性冗餘提供瞭特異性抑制致病性Th17細胞的方法。
結論和展望
我們的研究有著幾方面的意義：1.我們首次報道瞭可以特異性抑制致病性Th17細胞的方法，並且這種方法有可能不會產生巨大的毒副作用。我們已經開始與藥廠合作開發Gpi1特異的抑制劑，希望在不久的將來可以檢驗其實際療效以及毒副作用。另外，Gpi1缺失所導致的能量危機其根源在於低氧，因此，許多跟低氧有關的疾病也有可能會被Gpi1抑制劑所改善，譬如風濕性關節炎和腫瘤。如果藥物開發成功的話，許多自身免疫或者腫瘤病患，尤其是對目前治療方法沒有應答，或者目前方法毒副作用太大而無法接受治療的患者，都可以從這項研究中受益。2.我們的研究揭示瞭細胞代謝的網絡結構是非常”靈活的”(plastic)，其靈活性來源於眾多的冗餘元素。尤為重要的是，這些冗餘元素可以受到環境因素的影響，從而改變代謝網絡的“靈活性”(plasticity)（圖2）。這為我們尋找特異性的藥物靶點創造瞭很多機會。人類基因組中有代謝功能的基因目前已知的有3000多個，他們分佈在376條代謝通路中，而這些通路又相互交錯在一起（圖1）。在某種特定的細胞中，哪些元件是冗餘的，什麼因素調控著特定元件的冗餘，何種環境分子會影響冗餘，冗餘在哪個層面影響細胞功能，這些重要問題的答案都很不清楚。考慮到環境因素無窮無盡的多樣性（氧濃度，ROS，各種代謝產物和離子的濃度，溫度，pH，滲透壓，不同組織具有不同的細胞類型，導致不同組織中不同的細胞間信號傳遞，cytokine，chemokine等等），這些問題會變得更為復雜。我們將來的重點研究方向之一就是在自身免疫病和腫瘤動物模型中去研究這些問題，以期獲得新的疾病治療手段。需要特別指出的是，本研究涉及到生命科學眾多不同的領域，因此需要特別致謝紐約大學醫學院和紐約基因組中心各領域的教授，博士後和博士生的幫助。特別感謝Kate E.R. Hollinshead在metabolic tracing實驗上的幫助，以及Richard Possemato，Thales Papagiannakopoulos 和 Michael E. Pacold 關於代謝科學方面的討論。本文第一作者兼通訊作者武林博士於香港科技大學張明傑實驗室獲得博士學位，於紐約大學醫學院Dan Littman實驗室和紐約基因組中心Rahul Satija實驗室完成博士後訓練。目前開始準備籌建自己的實驗室（應為美國或者國內某著名研究機構，預計2021年中旬開張）。
除去本篇文章介紹的研究方向外（代謝冗餘以及環境因素的影響），課題組在腫瘤免疫和代謝，微生物和免疫，以及神經免疫方向均有涉獵，最終的目的是通過基礎科研的發現來開發創新性藥物。
所有對於課題轉化有貢獻的研究生和博士後將會公平的獲得應得的專利署名和股權利益。歡迎有意向在該時間段申請博士後的朋友來信交流（[email protected]）。具有免疫學，細胞生物學，生物化學，代謝，神經生物學，生物信息學背景的申請者會優先考慮。
原文鏈接https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.014
制版人：琪醬
參考文獻
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