明場顯微鏡觀察到的是白色背景、有色結構的圖像。在傳統的顯微觀察中，該模式已形成瞭一系列配套的技術體系，具有結構顯示全面、觀察條件簡便和結果保存性好等優點。在分子原位檢測的實驗中，反應的顯色產物有時可能被背景的雜質幹擾，判斷顯色結果和分子分佈的特異性有一定困難。熒光顯微術較好地解決瞭這個問題，基本原理是：用熒光染色劑或熒光基團標記的反應物與標本作用，使待檢結構具有特異性熒光發光。熒光顯微鏡（fluorescence microscope）觀察到的影像背景全黑，僅有目標結構發光。一般標本中發熒光的雜質很少，因此保證瞭檢測的特異性。
熒光（fluorescence）是一種受激輻射發光。當特定波長的光照射到某些原子時，光的能量使核周的部分電子由原來的軌道（基態）躍遷到瞭能量更高的軌道（激發態）；但激發態是不穩定的，電子會從激發態恢復到基態，能量以光的形式釋放，產生能量低於（波長長於）原激發光的熒光（圖1）。生物醫學領域最常用的單純熒光光色有藍色、綠色和紅色，激發它們的色光分別為紫外光、藍光和綠光。因此，多數熒光顯微鏡都至少要配置紫外、藍、綠3種濾光片。
觀察熒光發光，須采用落射式照明系統（圖2）。光路與明場顯微鏡的投射式照明不同，光源發出的光先穿過物鏡反向發出，落射在標本上，激發熒光；標本發出的熒光經過物鏡折射放大，按傳統的光路通過目鏡被觀察到。在落射式照明光路中，物鏡事實上還充當瞭聚光器的作用。切片的顯微觀察，先要用白光按投射式照明，找到目標部位，然後關閉透射光源，開啟落射式照明。由於需要用到高能量（小波長）的激發光，熒光顯微鏡的光源通常為高壓汞燈或氙燈。
熒光顯微成像雖然解決瞭背景幹擾的問題，但在結構反差、標本保存性等方面尚不能取代明場成像的技術。不過，在檢測分子水平的反應結果時，熒光顯微鏡觀察的是點光源，定位精度高於傳統的明場成像。20世紀90年代以後，不同模式的超高分辨率顯微鏡無一例外地以熒光顯微術為基礎而發展起來。